牛海绵状脑病之实验室诊断技术 _生活经验

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【牛海绵状脑病之实验室诊断技术】导读：BSE的诊断以组织病理学为主，并至少应配合免疫组织化学染色法或西方免疫墨点法或酵素连结免疫吸附分析法等其中一种检验方能进行确诊.……
一、简介
牛海绵状脑病 (bovine spongiform encephalopathy, BSE)，俗称狂牛病 (mad cow disease) ，是一种引起牛致死性的传染性神经退行性疾病。1985年4月在英国首次观察到牛有特殊的临床症状，于1986年诊断出病原，其病原不是传统的细菌或病毒等，但却有感染力，称之为变性普里昂蛋白质 (scrapie prion protein, PrPsc) 。
目前认为PrPsc会将神经细胞内正常的PrPc转化成PrPsc，而以等比级数的速度累积在神经细胞内，而造成神经细胞死亡，终使脑组织变成海绵样，所以是一种造成动物致死性神经变性的疾?。吵莆バ院Ｃ嘧茨圆?(transmissible spongiform encephalopathies, TSE) 或普里昂疾病 (prion diseases)，在人引起库贾氏症 (Creutzfeldt-Jakob Disease, CJD)、kuru症、Gerstmann-Straussler-Scheinker症候群 (GSS) 及致死性家族性失眠症 (fatal familial insomnia, FFI) 等，在牛引起BSE，在羊引起搔痒症 (scrapie)，在貂引起传染性貂脑病 (transmissible mink encephalopathy, TME)，在鹿与麋鹿引起慢性消耗病 (chronic wasting disease, CWD)，在猫、狮、豹引起猫科海绵状脑病 (feline spongiform encephalopathy, FSE)，许多动物皆有类似的疾病，在受感染宿主会形成脑组织的海绵状变性与神经胶细胞增生等病变。疾病之致病机序各有所不同，目前的研究显示BSE的爆发可能是牛饲料添加之肉骨粉中含有大量的羊搔痒症病原所致。
此外，近年的研究显示发现导致BSE的病原与发生在人类的变异型库贾氏症 (variant CJD) 有关，所以将BSE的病原假定为会染给人类。自从英国爆发BSE之后，至2001年止许多国家包括：奥地利、比利时、捷克、丹麦、芬兰、法国、德国、希腊、爱尔兰、意大利、日本、列支敦斯登、卢森保、荷兰、波兰、葡萄牙、斯洛伐克、斯拉维尼亚、西班牙、瑞士等国也陆续有病例发生，尤其是2001年日本有三个确诊病例，表示本病已由欧洲地区扩散至亚洲地区，所幸国内迄今未有病例报告。
因此为了防范BSE入侵我国，确保国民健康及畜牧产业之永续发展，亟需建立国内BSE诊断技术及诊断实验室，故笔者等于2001年7月28日至8月11日赴美国「国家普里昂疾病病理诊断中心」，2001年11月18日至23日接受国际畜疫会之邀请赴泰国参加「区域性牛海绵状脑病诊断与监测研习会」，研习BSE相关诊断技术，目前已符合国际畜疫会订定之诊断标准，建立本病之实验室生物安全、组织病理学诊断、免疫组织化学染色法、西方免疫墨点法及酵素连结免疫吸附分析法等诊断流程并持续进行本病之监控计划。
二、现行诊断方法
BSE的诊断以组织病理学为主，并至少应配合免疫组织化学染色法或西方免疫墨点法或酵素连结免疫吸附分析法等其中一种检验方能进行确诊，兹将已建立之实验室诊断方法详述如后：
(一) 组织病理学诊断法
将采集的牛脑组织置于10 % 中性福尔马林液固定完全后，取大脑、小脑及脑干共十个部位的脑组织，其重点部位为延脑 (medulla oblongata) 成"V"字形尖端的闩 (obex)，修整为约4mm的厚度，放入脱水包埋盒中，再浸泡于98%的蚁酸中1小时 (将具感染能力的prion不活化)，然后再浸泡于10%中性福尔马林液中2天。再依一般例行之病理切片方法，将组织块脱水、石蜡浸润、石蜡包埋等步骤，制作成3-5 m厚之切片，脱蜡后以H&E染色及封片，于显微镜下观察各部位脑组织切片中的病理变化。经H&E染色之组织切片于显微镜下进行判读，感染 BSE牛只在神经病理学上主要呈三个特殊病变为：1. 脑皮质灰质部产生空洞状退化。2. 神经元细胞坏死及数目减少。3. 神经星状胶质细胞增多 (astrocytosis)，使脑组织呈现海绵样变性 (spongiform change) 。若发现上述病变者，则判定为阳性，但仍需进行下列方法以进行确诊。
(二) 免疫组织化学染色法 (immunohistochemistry, IHC)
利用对prion蛋白质特异性的单株抗体及免疫染色技术来达到侦测牛脑组织中的PrPsc 为目的。其组织切片制作方法与组织病理学诊断之步骤相同，每次染色需同时染阳性对照切片。组织切片如常规进行脱蜡后，以磷酸盐缓冲液 (0.1M phosphate buffer solution, pH7.2, PBS) 洗3次，置于蛋白K溶液中37℃15分钟。将切片放入不锈钢盒中加入沸水，置于1bar 121℃高温高压灭菌器中20分钟后，再以PBS洗3次，然后置于3%双氧水溶液中10分钟，再以PBS洗3次。取出切片，组织周围以无尘拭纸吸干水分，置于保湿盘中，在组织上滴满5%的正常猪血清，于室温20分钟，倒掉血清，在组织上滴满PrP单株抗体 (F99/97.6.1, VMRD Inc.)，置于37℃4小时或隔夜，再以PBS洗3次，在组织上滴满次级抗体 (biotinylated secondary antibody, DAKO ChemMate detection kits)，于室温10分钟，以PBS洗3次，在组织上滴满受质 (peroxidase conjugated streptavidin, DAKO ChemMate detection kits)，置于室温10分钟，以PBS洗3次，再用蒸馏水洗去盐类，在组织上滴满呈色剂 (AEC or DAB substrate, DAKO ChemMate detection kits) ，于室温5分钟，用蒸馏水洗。滴上苏木精复染数秒，然后水洗，滴上封片胶，盖上盖玻片，置于显微镜下镜检。
(三) 西方免疫墨点法 (Western immunoblot method)
采用商品化检测套组 (PrionicsR-Check, Roche Applied Science)，其原理主要是侦测脑组织中对蛋白K有抵抗性的PrPsc，因为正常的prion蛋白质会被蛋白K所消化，而不正常的PrPsc对蛋白K具有抗性，只会被部分消化，所以分子量会由32-35kD变为27-30 kD 。选取延脑的闩 (obex) 或脑干或大脑灰质部的脑组织，秤重后加入均质液研磨成10倍均质乳剂，取100 l乳剂加10 l 消化缓冲液及10 l 蛋白K混合均匀后置于50℃加热40分钟，然后加10 l消化停止液以终止反应。再加入100 l PAGE样本缓冲液混合均匀，加热至96℃ 5分钟。架设电泳胶片，加入电泳缓冲液于电泳槽内。将待测样本及对照样本各加10 l于电泳胶片孔内以200伏特电泳30-45分钟。电泳胶片取出以湿式转渍器来进行转渍 (transfer) 至PVDF膜上，于4℃ 150伏特 1小时。然后取出膜加入以Ponceau S染色2分钟，标示标记分子的大小，然后以 TBST (Tris-Buffered-Saline with Tween) 脱色。以PVDF阻断缓冲液于室温震荡0.5-1小时，以1:5000倍稀释的单株抗体，置于震荡器上于室温反应1-2小时，然后以TBST洗4次，再以 1: 5000倍稀释的次级抗体，置于震荡器上于室温反应0.5-1小时，以TBST洗4次。将膜浸泡于 Luminescence 缓冲液中震荡5分钟，然后加入50 l CDP-Star于室温5分钟，然后将膜上的水分吸干，置于透明保护膜内于暗房中放入X光底片上压片，再冲洗底片观察结果。
(四) 酵素连结免疫吸附分析法 (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)
采用商品化检测套组 (BSE purification kit & PLATELIAR BSE detection kit, Bio-Rad)，此目前最快速且敏感的检测方法，乳剂之制备方法同前，取500 l乳剂加500 l蛋白K溶液 (1 ml denaturing solution+4 l proteinase K) 混合均匀，置于37℃ 10分钟，再加500 l clarifying solution，混合均匀后离心20000g 5分钟，倒掉离心管中的液体，并倒立于吸水纸上5分钟，然后各加50 l resolving buffer，置于100℃加热5分钟，混合均匀后加入250 l sample diluent 。取出检测盘，于孔内分别加入100 l阳性对照、阴性对照及待测样品，用胶片封盘，置于37℃感作75分钟。以washing solution清洗三次，拍干后加100 l conjugate，再用胶片封盘，置于4℃感作60分钟，以washing solution清洗五次，拍干后加100 l revelation solution ，置于室温下之暗室30分钟，加100 l stopping solution，以450/620 nm 波长ELISA reader读取结果。
三、其它诊断方法
目前BSE的诊断除了前述的四种方法外，陆续可能还有许多更新的检验技术与检验套组会不断地被开发出来，但目前大多仍处于研究阶段未能普遍地被应用于诊断。例如在检验技术方面，有些实验室应用基因转殖鼠 (transgenic mice) 来进行人工动物接种试验，大幅缩短原先接种小白鼠所需的292天潜伏期，但因实验动物的饲养较费人力，且需在符合生物安全三级的阴压动物舍饲养，所以目前仍只应用于研究领域。
另外在脑脊髓液的检验方面，由BSE的确诊病例发现，藉由双向电泳分析法 (two dimensional gel electrophoresis) 可侦测出指标性蛋白质apolipoprotein E，但目前尚无法应用于临床诊断，因为这种蛋白质不具特异性，只可作为神经退行性变化的非特异性指标。同样地，从脑脊髓液中侦测14-3-3蛋白质的方法，或是藉由脑脊髓液与血清侦测S-100蛋白质也因特异性低，同样不适用于BSE的诊断。
至于活体检验部分，目前只有利用免疫组织化学染色法应用于羊搔痒症之扁桃腺与眼瞬膜进行活体检验，但是根据实验接种牛的结果发现，不仅在潜伏期，甚至在临床发病期都无法从淋巴组织侦测到具有感染力的prion，故不能应用于BSE的诊断，所以目前仍有许多学者正在积极地研发其它活体生前的检验方法。
亦有学者藉由电子化学分析法 (electrochemical analysis) 侦测感染prion动物尿液中的代谢物，但是这种方法的敏感性和特异性较低，目前仍不建议用作单一的诊断法。
在检验套组方面，目前除了前述商品化的免疫西方墨点法与酵素连结性免疫吸附法检验套组之外，目前较新的检验套组同样是利用ELISA的原理，只是改用冷光 (chemiluminescence) 来呈色以提高其敏感性与特异性。虽然新的检验技术不断地推陈出新，但是由于许多新的检验方法缺乏真实之黄金诊断标准 (true gold standard)，而且因为随着潜伏期的不同对前述检验方法的敏感性也有所不同，若是要应用在诊断仍需再评估。根据国际畜疫会的建议，若是在发生率低的地区或是非疫区的监控仍是以组织病理学诊断与免疫组织化学染色为主。

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